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    我國田間發現低致死率非洲豬瘟基因II型自然變異流行株

    • 分類:行業動態
    • 作者:
    • 來源:
    • 發布時間:2021-03-01 14:23
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    【概要描述】

    我國田間發現低致死率非洲豬瘟基因II型自然變異流行株

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    2020年,中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所國家非洲豬瘟專業實驗室在開展非洲豬瘟流行病學監測及病原學研究中發現,我國部分省區出現了低致死率的非洲豬瘟基因II型自然變異流行株。這些變異株至少包括4種CD2v編碼失活突變類型,導致病毒粒子失去吸附紅細胞表型;相比典型強毒致病力降低,但仍具有明顯的殘留毒力,較高劑量接種豬可引起亞急性、慢性病程和部分死亡,較低劑量感染則主要引起持續感染和慢性病程,具有很強的水平傳播能力。這些變異株臨床表現具有一定的隱蔽性,早期診斷難度加大,為我國非洲豬瘟防控帶來全新的挑戰,必須加以高度重視,盡快制定和采取應對策略。

    (相關研究論文 “Emergence and prevalence ofnaturally occurring lower virulent African swine fever viruses in domestic pigsin China in 2020” 已于2021年2月24日在線預發表在SCIENCE CHINA Life Sciences。)

    非洲豬瘟(African Swine fever,ASF)是由非洲豬瘟病毒(African Swine Fever Virus,ASFV)引起的各年齡段家豬與野豬的急性、烈性、高度接觸性且高發病率和死亡率的傳染病,給養豬業帶來嚴重的經濟損失并威脅全球糧食安全。目前尚無商品化疫苗或有效的治療方法。ASF被世界動物衛生組織(OIE)列為應通報疾病,世界糧食及農業組織將其列為主要跨界動物疾病。該病1914年首次報道于非洲肯尼亞,1957年從非洲傳至葡萄牙,現在主要流行于非洲、東歐和亞洲,給世界范圍內生豬產業帶來巨大威脅。ASFV結構復雜,在環境中極其穩定。ASFV在家豬和野豬中長期流行傳播,造成病毒遺傳變異多樣化。根據B646L基因(P72)可變3'-末端的核苷酸序列,ASFV已鑒定出至少24種基因型。目前,歐洲主要流行基因I和II型,而亞洲主要流行基因II型。

    2018年8月,ASF傳入我國并迅速擴散,給我國生豬產業造成了巨大的經濟損失,尚無產業化應用的疫苗和藥物,早期診斷及感染豬群撲殺是目前防控主要策略。流行病學監測及流行株的基因組變異、生物學表型及致病力研究對非洲豬瘟防控具有關鍵指導意義。中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所國家非洲豬瘟專業實驗室于2018年首次分離鑒定了我國第一株非洲豬瘟病毒Pig/HLJ/2018(HLJ/18),動物回歸試驗證實HLJ/18感染家豬表現為急性病程及高度致死。非洲豬瘟已在我國流行了兩年多,田間流行毒株的基因組變異及生物學和致病性表型進化亟待解析。

    1. 非洲豬瘟病毒監測

    2020年6月至12月,國家非洲豬瘟專業實驗室按照農業農村部畜牧獸醫局統一安排,執行《農業農村部畜牧獸醫局關于調整部分省份非洲豬瘟監測工作的通知》及《農業農村部畜牧獸醫局關于調整規模豬場等場所非洲豬瘟采樣檢測任務分工的通知》(農牧便函〔2020〕670號)的要求,對黑龍江、吉林、遼寧、內蒙古以及陜西5省進行常態化非洲豬瘟主動監測與流行病學調查,總計采集并檢測、分析病原學樣品3522份;同時,對部分省市送檢的138份疑似陽性樣品進行了鑒定及檢測。所有樣本使用OIE推薦的qPCR方法對病毒p72基因進行檢測。ASFV DNA陽性樣品利用豬原代肺泡巨噬細胞(PAM)進行病毒分離,最終成功分離到22株非洲豬瘟病毒(表1)。

    2. ASFV分離株的遺傳變異分析

    為了分析22株病毒的遺傳變異情況,選取ASFV重要的抗原基因、毒力決定基因和高突變區的23個ORF或區域進行了克隆測序。序列分析表明,所有分離株B646L基因(p72蛋白)序列與HLJ/18一致,均屬于基因II型。23個ORF或區域中的15個未產生任何突變。而余下8個ORF或區域(MGF_110-14L、MGF_110-1L、EP402R、CP530R、E199L、O174L、TRS以及A238L)存在不同程度的核苷酸突變和缺失、片段插入及小片段替換情況(圖1)。

    表1:22株2020年田間分離ASFV 

          將22株ASFV分離株的EP402R基因(編碼CD2v蛋白)序列與我國第一株強毒分離株HLJ/18基因組序列比較分析發現,有11株病毒存在核苷酸突變或缺失:HLJ/HRB1/20病毒在其EP402R基因的第43-67位缺失25個核苷酸;9株病毒(HLJ/JMS3/20、HLJ/JMS5/20、HLJ/JMS9/20、HLJ/JMS11/20、HLJ/BLA3/20、HLJ/BLA6/20、HuB/1/20、HuB/4/20以及HuB/SP1/20)存在G131A突變,此外,三株湖北分離株還存在G178A和G242A的突變;HeB/Q3/20存在C301T突變(圖1)。這些突變或缺失導致病毒CD2v蛋白翻譯提前終止,不能編碼出完整有功能的CD2v蛋白。CD2v是病毒吸附紅細胞活性(HAD)所必須的重要蛋白,通過HAD試驗證實所有CD2v蛋白翻譯提前終止的突變株均喪失紅細胞吸附能力(表1)。
    MGF_110-1L位于非洲豬瘟病毒基因組高變區,分析發現分離株的MGF_110-1L基因呈現一定的多態性(圖2)。系統進化樹分析顯示,17株病毒與HLJ/18在一個分支,湖北分離的3株(HuB/1/20、HuB/4/20以及HuB/SP1/20)及HLJ/HRB1/20和HeB/Q3/20在另一個分支,而HLJ/HRB1/20和HeB/Q3/20又處在該分支的不同位置(圖2A)。其中第二個分支五株病毒的MGF_110-1L第 654至649位核苷酸序列不同于其他毒株,該片段可能來源于病毒基因組的其他部位,從而發生了小片段的替換。這種替換使五株病毒的MGF_110-1L蛋白與其他病毒相比多了73個氨基酸(圖2C)。此外,與HLJ/18相比,所有分離株在MGF_110-14L基因中都有1-6個C缺失或插入(圖1);六株病毒在CP530R、O174L或E199L基因具有單點突變(圖1);HLJ/BY2/20和JL/1/20病毒在I173R和I329L基因之間插入了10個核苷酸的串聯重復序列(TRS)(圖1)。

    圖1. 2020年中國22株田間分離的ASFV存在核苷酸插入、缺失、突變和替換。將22株ASFV的8個ORF或相關區域與中國第一株ASFV分離株HLJ/18(Pig/HLJ/2018)相應序列進行比對。ORF或區域的名稱標注于每部分的上方。

    文獻證明A238L基因能抑制NF-κB和NFAT介導的先天免疫反應,進而逃避宿主免疫應答。序列分析發現,HLJ/HRB1/20病毒A238L基因的536-549位發生14個核苷酸的缺失,造成其自179位氨基酸開始移碼,與其它毒株相比增加了4個氨基酸(圖1)。對HLJ/HRB1/20進行全基因組序列測定(GenBank 登錄號MW656282),分析發現其基因組上沒有明顯的人工改造標記,如報告基因或標簽等。

    圖2. MGF_110-1L基因遺傳變異分析。2020年田間分離的22株病毒與HLJ/18的MGF_110-1L基因系統進化樹(A)。利用Neighbor-joining方法對MGF_110-1L序列進行分析繪制系統進化樹(Bootstrap value=1000)。與HLJ/18相比,分離株MGF_110-1L基因的核苷酸差異(B)和氨基酸差異(C)。

    3. ASFV分離株的體外培養特性鑒定

    根據分離地點及基因組遺傳變異特點,我們選取四株ASFV(HuB/628/20、HLJ/44/20、HLJ/HRB1/20和HeB/Q3/20)進行體外生物學特性分析。間接免疫熒光(IFA)結果顯示4株病毒均可以在PAM細胞上進行有效復制(圖3A)。HAD試驗確定HuB/628/20和HLJ/44/20可以形成典型的HAD表型;但HeB/Q3/20和HLJ/HRB1/20呈現HAD表型陰性,不能吸附紅細胞(圖3A),與基因組變異分析結果一致。電鏡觀察四株病毒之間沒有明顯的形態學差異(圖3A)。復制動力學顯示,四株病毒可以在PAM中有效復制,感染后第五天細胞上清液中的p72基因拷貝數均大于108/mL(圖3B)。

    圖3. ASFV分離株體外生物學特征。(A)將HuB/628/20,HLJ/44/20,HeB/Q3/20和HLJ/HRB1/20以MOI為0.1感染PAM,接種24小時后固定細胞,使用間接免疫熒光(IFA)進行分析;以MOI為0.2感染PAM,進行HAD測定;通過電子顯微鏡(EM)進行分離株形態觀察。(B)分離株在PAM上生長特征。以MOI為0.1的病毒劑量感染PAM,不同時間點收集細胞上清,利用qPCR測定上清液中病毒p72基因拷貝數。

    4. HAD表型陽性的分離株接種豬急性發病、高度致死

    對HAD表型陽性的兩株病毒HuB/628/20和HLJ/44/20,進行動物回歸試驗,評估其對家豬的致病力。分別以102和103 HAD50兩個劑量肌肉注射接種豬,每劑量4頭,每天觀察接種豬臨床癥狀和死亡情況。HuB/628/20感染豬第3天起開始出現發病癥狀,包括發熱、精神沉郁、皮膚發紺或呼吸窘迫;感染后后第5-8天全部發病死亡。HLJ/44/20感染豬第3天起出現癥狀;在接種后第5-6天全部死亡(表2和圖4)。結果表明,HuB/628/20和HLJ/44/20對家豬的致病力與HLJ/18相當,對家豬都表現高度致死。

    表2:感染不同田間分離株的豬發病情況

    表注:a,沒觀察到發病癥狀;b,觀察期內豬存活。

    5. 缺失HAD表型(non-HAD)分離株毒力降低,接種豬引起持續感染、慢性病程和部分死亡

    已有研究證明CD2v是影響非洲豬瘟病毒毒力的重要功能基因之一。人工缺失CD2v編碼基因可降低BA71株(基因型I)和HLJ/18株(基因型II)對家豬致病力,但CD2v編碼基因缺失不影響Malawi Lil-20/1和Georgia 2010分離株的致病力。為了明確CD2v編碼失活對我國田間毒株致病力的影響,我們選取2株non-HAD病毒進行動物回歸試驗。其中一株為CD2v編碼區發生25個核苷酸缺失的黑龍江分離株HLJ/HRB1/20,另一株為CD2v基因301位突變的河北分離株HeB/Q3/20。用106TCID50和103 TCID50兩個劑量分別接種SPF豬,每劑量接種4頭,持續觀測28天。

    圖4. 2020年ASFV分離株對豬致死性分析。為了評估ASFV對豬的致病性,將16頭無特定病原體(SPF)豬隨機分為4組,分別以102和103 HAD50劑量接種HuB/628/20(A)和HLJ/44/20(B)毒株;將16頭SPF豬平均分為4組,分別以103106TCID50劑量接種HLJ/HRB1/20(C)和HeB/Q3/20(D)分離株。從接種之日起,將兩頭SPF豬與106TCID50劑量接種豬同居飼養。每天記錄豬的發病和存活情況。

    結果發現, HLJ/HRB1/20分離株106 TCID50接種組有2頭豬在接種后的第10天出現持續體溫升高現象(>40.5℃),第13天共有3頭豬出現體溫升高,另一頭豬在接種后第22天出現持續體溫升高。103 TCID50接種豬1頭在接種后第17天出現持續體溫升高,另一頭豬在接種后第9-12天持續4天高溫(表2)。106 TCID50 接種4頭豬有3頭分別在接種后第16天、23天和24天死亡,有1頭豬存活;103 TCID50接種的4頭豬全部存活(圖4)。106 TCID50接種豬普遍出現關節腫大、腹部和胸部皮膚腫塊凸起,腹部臍帶處出現皮膚潰爛等亞臨床癥狀(圖5)。103 TCID50 接種豬也出現了明顯的關節腫大現象。對采集的口拭子及肛拭子進行qPCR病毒核酸檢測發現,106TCID50接種豬自接種后第4天開始口腔排毒,其存活豬排毒一直持續到接種后第22天;第10天開始肛門排毒,其存活豬排毒持續到接種后第24天(圖6)。103 TCID50接種豬在接種后第8天開始出現口腔排毒,在接種第24天后仍有個別豬高水平口腔排毒;在接種后第10天開始肛門排毒(圖6)。接種后不同時間采集抗凝血進行qPCR核酸檢測,106 TCID50接種豬有2頭在接種第3天血液中即可檢測到低水平病毒核酸拷貝,第5天起4頭豬血液中全部檢測到病毒(圖6)。103 TCID50接種豬血樣檢到病毒起始時間較高劑量組滯后2天,且血液中病毒含量低于高劑量組(圖6)。

    圖5. HLJ/HRB1/20接種豬的臨床癥狀和組織損傷情況。接種豬表現出關節腫脹(A)、癱瘓(B)、皮膚腫塊(C)和皮膚壞死(D)等臨床癥狀。剖檢可見組織損傷變化包括絨毛心(E)、腹腔積液(F)、關節炎(G)、扁桃體損傷(H)和淋巴結(上頜下淋巴結(I)、腹股溝淋巴結(J)和縱隔淋巴結(K))充血。

    HeB/Q3/20分離株106 TCID50接種組有2頭豬第8天出現持續體溫升高現象,第9天4頭豬全部體溫升高,表現出與HLJ/HRB1/20高劑量攻毒組相似的臨床癥狀(表2);第14天有2頭接種豬發病死亡。103 TCID50接種組有2頭豬第8天出現持續體溫升高。103 TCID50攻毒組的4頭豬28天觀察期內均存活(圖4);除皮膚壞死外,所有存活豬均表現出與HLJ/HRB1/20低劑量攻毒組的豬相似的病程和臨床特征(表2)。

    2018年分離的我國第一株非洲豬瘟流行株HLJ/18,在接種后第3天所有豬就出現體溫持續升高,第4天口拭子排毒,第5天肛拭子排毒,10天之內接種豬全部死亡(Zhao D et al, EMI, 2019)。相比之下,兩株CD2v功能失活自然變異株HLJ/HRB1/20和HeB/Q3/20對SPF豬致病力均顯著降低。

    圖6. HLJ/HRB1/20接種豬和同居豬采集樣品中的病毒載量。在接種后不同時間點采集接種豬和同居豬的口腔拭子、肛拭子及血液樣本,通過qPCR檢測樣品中的病毒p72基因拷貝數。黑色虛線表示檢測下限,1000拷貝/毫升。星號表示由于豬死亡,在指定的時間點無樣品。

    6. HLJ/HRB1/20攻毒豬剖檢病變及組織病毒載量

    對HLJ/HRB1/20分離株 106 TCID50接種組的3頭病死豬以及存活至28天試驗豬進行剖檢,組織器官病理損傷主要表現為淋巴結充血和腫脹、絨毛心、心包積液及扁桃體炎癥(圖5),其中2頭豬還出現腹膜炎。HLJ/HRB1/20 103 TCID50接種存活豬均出現心包積液(表3)。利用qPCR對心臟、肝、脾、肺、腎、扁桃體和六個淋巴結(腸淋巴結,腹股溝淋巴結,上頜下淋巴結,支氣管淋巴結,胃肝淋巴結和縱隔淋巴結)進行病毒基因組核酸檢測,結果顯示,在所有病死及存活豬各組織均檢測到病毒核酸,106 TCID50攻毒組3只死亡豬的多種組織病毒載量明顯高于存活豬;各種組織中,肺、扁桃體和部分淋巴結中檢測到病毒載量相對更高(圖7)。

    圖7. HLJ/HRB1/20接種豬與同居豬臟器中的病毒載量。對死亡豬以及接種28天后存活豬進行剖檢,采集各種臟器樣品進行病毒核酸檢測。106 TCID50接種組(A)或103 TCID50接種組(B);與106 TCID50接種組同居的豬(C)。利用qPCR方法檢測病毒p72基因拷貝數。黑色虛線表示檢測下限。LN1:腸淋巴結;LN2:腹股溝淋巴結;LN3:上頜下淋巴結;LN4:支氣管淋巴結;LN5:胃肝淋巴結;LN6:縱隔淋巴結。

    7.    缺失HAD表型(non-HAD)分離株表現出很強接觸傳播能力

    為了評估non-HAD病毒株接觸傳播能力,從感染的第一天起,分別將兩頭SPF仔豬與106 TCID50劑量HLJ/HRB1/20和HeB/Q3/20接種豬同居飼養,每天觀察其臨床體征和溫度變化,采集血液、口腔拭子以及肛拭子,qPCR檢測病毒核酸,評估水平傳播能力。

    HLJ/HRB1/20接種組的兩頭同居豬,分別于第6天和第12天從口腔拭子中檢測到病毒核酸,第8天和第20天從肛拭子中檢測到病毒核(圖6);第21天從一頭豬的血樣中檢測到病毒核酸(圖6)。兩頭同居豬在同居后第28天均未出現明顯的臨床癥狀,同居后第28天進行了安樂死,剖檢觀察發現部分組織發生輕度病變,包括淋巴結充血、腫大、萎縮與出血點以及肺炎等(表3)。組織器官病毒載量檢測發現,一頭豬的心臟、脾臟、肺、腎、扁桃體、滑膜、腸道淋巴結、腹股溝淋巴結、上頜下淋巴結、支氣管淋巴結、胃肝淋巴結和縱隔淋巴結均檢測到病毒核酸;而另一頭豬,主要在支氣管淋巴結和縱隔淋巴結中檢測到病毒核酸(圖7)。

    表3. HLJ/HRB1/20(non-HAD)感染豬及同居豬剖檢觀察

    表注:a,沒有觀察到病理損傷。

    HeB/Q3/20 接種組的2頭同居豬有1頭豬在第8天從口腔拭子中檢測出病毒核酸,第6天從肛拭子中檢測出病毒核酸;第17天在兩頭豬的血液都檢測到病毒核酸;兩頭豬所出現的發病病程與癥狀與103 TCID50攻毒組豬相似(表2),其中1頭同居豬第24天發病死亡,另一頭28天觀察期內存活(圖4)。

    ASFV已在我國流行兩年有余,但有關流行毒株的進化以及致病性表型研究鮮有報道。本研究報告了2020年6月至12月在我國部分省份開展的較為系統的ASFV流行病監測工作,共分離出22株基因II型ASFV流行毒株。與最早的分離株HLJ/18相比,所有2020年分離株基因組序列均發生不同程度的改變,包括核苷酸突變、缺失、插入或短片段替換等。其中11株病毒的EP402R基因呈現四種不同類型的核苷酸自然突變或缺失,造成這些CD2v蛋白編碼缺陷,失去HAD表型。選取4株代表性病毒進行了動物回歸試驗,發現具有HAD表型的2株病毒致病力與HLJ/18相當,表現為典型高致死性;而2株缺失HAD表型分離株顯示出較低的毒力,但依然表現出明顯的毒力殘留,高劑量感染能引起亞急性和慢性病程,并部分致死感染豬只;低劑量接種主要引起非致死性的持續感染,以及亞急性或慢性病程。兩株病毒均具有很強的水平傳播能力,尤其HeB/Q3/20表現更為突出。

    當前尚無批準疫苗用于ASF的防控。ASF防控主要依靠對感染動物的快速診斷和及時清除。本研究發現,田間至少存在4種以上的non-HAD低致死率基因II型自然變異株,雖然致病力較典型強毒株明顯降低,但仍然呈現明顯的殘留毒力,且具有很強的水平傳播能力,很可能已在田間豬群中廣泛傳播,造成持續的感染、慢性病程甚至死亡,給非洲豬瘟早期診斷帶來巨大的障礙,為我國非洲豬瘟防控帶來全新的挑戰,必須加以高度重視,制定和采取應對策略。

    中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所國家非洲豬瘟專業實驗室孫恩成副研究員、張振江博士、王子龍博士、何希君研究員為論文共同第一作者,步志高研究員和趙東明研究員為共同通訊作者。該研究得到國家重點研發項目(2018YFC1200601)等項目資助。

    原文鏈接:

    http://engine.scichina.com/doi/10.1007/s11427-021-1904-4

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